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En el laboratorio de Ed Boyden, los estudiantes de primer año y postdoctorados reciben el equipo básico de su profesión: micropipetas, una computadora portátil, una computadora y una linterna. Desde señales para bicicletas hasta luces para acampar, cada miembro del laboratorio tiene una luz portátil en su mesa para visualizar muestras de tejido cerebral en sus placas de laboratorio.
Estos no son especímenes comunes y el tamaño del tejido ha sido ampliado 100 veces, lo que es similar a inflar un disco de hockey al tamaño de una piedra para curling. En el proceso, se vuelven casi transparentes, como medusas vulnerables en un mar de materiales aislantes.
A simple vista, estos ejemplares sólo se pueden percibir cuando se iluminan en ángulo oblicuo, de ahí las luces. Sin embargo, bajo el microscopio, las muestras están claramente definidas, revelando características celulares que sólo pueden verse utilizando los microscopios más avanzados.
Boyden, neurocientífico e ingeniero biológico del Instituto Tecnológico de Massachusetts (MIT) en Cambridge, fue el primero en describir1 Técnica de ampliación de tejidos en enero de 2015 (esta semana hace diez años) en un artículo titulado sucintamente “Microscopía extendida”.
El tejido transparente enfoca las células para el examen microscópico
En la década siguiente, al menos 700 artículos primarios utilizaron microscopía de extensión extendida, o “ExM”, según un recuento actualizado llevado por Boyden. A lo largo del camino, investigadores de todo el mundo han mejorado esta técnica para que sea más versátil y adecuada para su propósito que la técnica original, o la han combinado con otros métodos de última generación para explorar la función y la organización espacial de las proteínas y moléculas nucleares. Ácidos y otras biomoléculas.
ExM expande el tejido “isotrópicamente”, es decir, uniformemente en todas direcciones, del mismo modo que la imagen en un globo inflado permanece proporcional y sin distorsiones. Al hacerlo, esta técnica extiende efectivamente el poder de resolución de los microscopios convencionales más allá del límite de difracción, generalmente alrededor de 200 nanómetros, momento en el que las características finas se vuelven indistinguibles.
La microscopía de superresolución rompió esta barrera mucho antes de la llegada de la ExM, pero depende de instrumentos complejos y costosos. ExM proporciona detalles comparables utilizando equipos estándar, lo que hace que las imágenes a nanoescala sean accesibles para cualquier persona con un microscopio de fluorescencia. “Es una tecnología de súper precisión para los pobres”, dice Anne-Sophie Hafner, neurobióloga celular de la Universidad Radboud en Nijmegen, Países Bajos.
Este método es incompatible con las imágenes de células vivas y carece del detalle a nivel atómico que sólo algunas de las técnicas más caras y sofisticadas pueden proporcionar. Pero ExM está cerrando la brecha constantemente. Innovaciones recientes han permitido a los investigadores observar los complejos moleculares y sus componentes con una resolución de aproximadamente un nanómetro.
“De hecho, podemos ver moléculas individuales”, dice Silvio Rizzoli, neurocientífico y nanotecnólogo del Centro Médico Universitario de Göttingen, en Alemania. “La microscopía extendida le brinda oportunidades que nada más tiene”.
“Una especie de magia”
Boyden comenzó a explorar la idea de ampliar muestras de tejido para obtener imágenes a nanoescala ya en 2007, y ha escrito notas de esas sesiones de lluvia de ideas para demostrarlo.
Brian Zhao, un ex investigador postdoctoral en el laboratorio de Boyden que participó en esas primeras discusiones, recuerda haber pensado: “Esto es tan loco que podría funcionar”. Pero cuando probó algunos de los materiales en el laboratorio, ninguno era adecuado.
Zhao, que ahora trabaja en la firma de inversión en atención médica Deerfield en la ciudad de Nueva York, ha pasado a otros proyectos. Pero cinco años después, los estudiantes de posgrado Fei Chen y Paul Tilberg intentaron otra vez. Su avance se produjo con la identificación de un gel “inteligente”, que había sido descrito décadas antes.2. Sus polímeros en forma de cadenas pueden hincharse y extenderse hasta más de cuatro veces su tamaño original en todas direcciones cuando se sumergen en líquido.
Microscopía de expansión: principios y usos en la investigación biológica.
Una noche de 2012, en el sótano sin ventanas del laboratorio de Boyden en el MIT, Chen y Tilberg sumergieron una porción del cerebro en un baño de bloques de construcción de gel, agregaron químicos para estimular la formación de gel y colocaron la muestra en agua. A medida que pasaba la medianoche, observaron y esperaron.
“Fue algo mágico”, recuerda Chen, que ahora dirige un laboratorio de genómica espacial en el Instituto Broad del MIT y la Universidad de Harvard en Cambridge. “Podemos ver literalmente cómo el cerebro se expande ante nuestros ojos”.
Cuando salió el sol sobre el cercano río Charles, Tilberg, que continúa desarrollando el programa ExM en el Campus de Investigación Janelia del Instituto Médico Howard Hughes en Ashburn, Virginia, se fue a la cama pensando: “Está bien, esto realmente va a funcionar”.
Los investigadores perfeccionaron su método durante el año siguiente y se decidieron por un protocolo de cuatro pasos que sigue siendo la piedra angular de ExM hasta el día de hoy. Usándolo, el equipo de Boyden tomó imágenes de conexiones sinápticas en el cerebro del ratón, logrando una resolución de aproximadamente 70 nanómetros.
Desde entonces, la comunidad de investigadores ha introducido cambios como diferentes químicas de gel, condiciones de reacción y procedimientos de hinchamiento, que en conjunto han aumentado la expansión de la muestra y han empujado la resolución por debajo de 20 nm. Pero así como los cuatro ingredientes principales de la cerveza (malta, agua, lúpulo y levadura) pueden producir una diversidad notable en las bebidas, los pasos básicos de ExM se han mantenido en gran medida constantes, incluso cuando la metodología ha avanzado y evolucionado (ver “Grandes cerebros” ).
Fuente: En Wasi et al. Los métodos de la naturaleza. 1633-41 (2019)
Panorama más amplio de la biología
El primer paso consiste en fijar la muestra y luego aplicar un tipo de “fijador” para unir moléculas de interés, como proteínas, al soporte del gel. Luego, a la muestra se le infunden los elementos esenciales del gel inteligente; Chen y Tilberg utilizan el mismo material absorbente que se encuentra en los pañales para bebés. Estos precursores se polimerizan y se unen a estabilizadores para formar una red densa que impregna cada célula.
Luego, la muestra se “ablanda” usando enzimas, detergentes o calor, haciéndola flexible para el cuarto paso: con la adición de agua, el tejido se hincha gradualmente y se vuelve transparente. Con la ayuda de sondas fluorescentes, esto revela detalles moleculares complejos cuando las muestras finalmente se examinan bajo un microscopio.
La próxima generación de microscopía de expansión.
Todo el proceso suele tardar uno o dos días, y hay protocolos paso a paso disponibles en sitios web como Expansionmicroscopy.org, que Boyden ha coordinado durante la última década. Los líderes en el campo también organizan periódicamente talleres prácticos, principalmente en Europa y Estados Unidos, pero en los últimos años también se han llevado a cabo en partes del mundo que históricamente han tenido acceso limitado a equipos de imágenes avanzados.
“Quiero eliminar las barreras técnicas”, dice Xiaoyu Shi, biofísico celular de la Universidad de California, Irvine, quien codirigió uno de esos talleres en Uruguay. “Quiero que este método llegue a todos los rincones de la biología, para que la gente pueda utilizarlo e, incluso con poco dinero, desarrollar sus capacidades de obtención de imágenes”.
El año pasado se celebró otro taller en Ghana. Aquí, el biólogo celular Yaw Anyweh, del Centro de Biología Celular de Patógenos Infecciosos de África Occidental en Accra, utiliza ExM para estudiar adaptaciones estructurales en aislados clínicos de parásitos de la malaria y otros parásitos endémicos de la región. “En un entorno típico con recursos limitados como el nuestro, nadie tiene un microscopio electrónico”, afirma Aniweh. “La expansión es la mejor herramienta que tenemos”.
Innovación adaptable
A medida que esta herramienta ganó fuerza, los investigadores la adoptaron de manera creativa y formularon modificaciones para abordar una variedad de desafíos. “Esta es una de las cosas buenas de escalar: no sólo cualquiera puede hacerlo, sino que también puedes modificarlo tú mismo”, dice Boyden.
“La filosofía básica sigue siendo la misma, pero cada uno de estos pasos se puede modificar para adaptarlo a tu corazón”, añade.
Joshua Vaughan, investigador de bioimagen de la Universidad de Washington en Seattle, recuerda haber leído el informe inicial del ExM con una mezcla de entusiasmo y escepticismo. Recuerda haber pensado: “O esto es un gran problema y cambiará la forma en que mucha gente hace las cosas, o hay algún tipo de engaño y es demasiado bueno para ser verdad”.
Resultó ser lo primero. “No pude encontrarle ningún defecto”, dice Vaughan.
Pero pudo mejorar el asunto simplificando el procedimiento para utilizar proteínas fluorescentes y anticuerpos fácilmente disponibles para estabilizar la matriz del gel.3 En lugar de investigaciones ad hoc que sean más complejas que el informe original. Independientemente, y casi al mismo tiempo, el equipo de Boyden4 Y un grupo separado5 Informaron sus propios protocolos simplificados.
La noticia se difundió rápidamente, incluso en las redes sociales, donde llamó la atención de Paul Guichard y Virginie Hamel. Los biólogos celulares estructurales han dedicado sus carreras a desentrañar la compleja estructura de los centriolos, orgánulos en forma de barril involucrados en la división y organización celular. Pero cuando terminaron su investigación postdoctoral y formaron un grupo de laboratorio conjunto en la Universidad de Ginebra en Suiza en 2015, ya no tenían acceso al equipo multimillonario que necesitaban para visualizar estructuras celulares a nanoescala.
Los poros nucleares se muestran utilizando una forma de microscopía de estructura fina (derecha) en comparación con ninguna expansión (izquierda) y una forma de microscopía de superresolución (centro).Crédito: V. Lovell et al./Naturaleza común.
Deseosos de encontrar una solución alternativa adecuada, probaron los protocolos ExM existentes, pero descubrieron que los centríolos se expandían de manera desigual, lo que afectaba la precisión estructural. Sin inmutarse, Guichard y Hamel mejoraron la química del gel y optimizaron los procesos de fijación y etiquetado para preservar la compleja forma del orgánulo.6. Esta alternativa optimizada a la subestructura, llamada U-ExM, permitió a los investigadores construir un modelo mecanicista del ensamblaje del centríolo humano.7. Ha demostrado una habilidad similar en el mapeo de la estructura molecular de mitocondrias, microtúbulos y microorganismos unicelulares.
En este último caso, la U-ExM ha descubierto un tesoro de formas estructurales extrañas e inesperadas en microalgas cultivadas en laboratorio: hélices retorcidas, filigranas ramificadas y más. Hamel, Guichard y sus colegas ahora están ampliando estos estudios para incluir muestras de agua recolectadas a lo largo de las costas desde el Mar Báltico hasta el Mediterráneo, con el objetivo de compilar un atlas de diversidad citoesquelética, a través del cual se pueda rastrear el impacto del cambio climático en las comunidades de plancton. .
“Es un mundo nuevo”, dice Guichard. “Hay muchas organizaciones estructurales que no hemos visto antes”.
Enfoque único
Y nunca antes habíamos visto -al menos no con herramientas tan directas- los detalles nanoscópicos revelados gracias a los avances.8 Así lo informaron en octubre Rizzoli, Ali Chaib, también en Gotinga, y sus colegas.
En el corazón del enfoque de expansión a nanoescala de un solo paso (ONE) se encuentra una tecnología analítica que captura miles de imágenes de la muestra a medida que las señales fluorescentes de los fragmentos de proteínas etiquetados se encienden y apagan. Luego, estas imágenes son procesadas por un algoritmo de inteligencia artificial, que reconstruye la estructura molecular de la muestra con una resolución casi atómica.
Cuando se aplicó al receptor de neurotransmisores en el cerebro, un solo examen microscópico reveló características que han eludido incluso las técnicas experimentales alternativas más avanzadas. “Esta resolución ha superado con creces la capacidad de la superresolución convencional”, afirma Scheib.
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